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明細胞腎細胞癌の早期診断のための循環エキソソーム mRNA サイン

Oct 09, 2023

BMC Medicine volume 20、記事番号: 270 (2022) この記事を引用

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1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

これまでのところ、明細胞腎細胞癌 (ccRCC) の早期診断のための証明された腫瘍バイオマーカーはありません。 この研究は、エキソソーム mRNA (emRNA) プロファイリングに基づいて ccRCC の新規バイオマーカーを特定し、ccRCC の早期検出のための emRNA ベースのシグネチャを開発することを目的としました。

226 人の限局性 ccRCC、73 人の腎良性腫瘤患者、および 189 人の健康な対照を含む 488 人の参加者が募集されました。 発見段階では、12 個の ccRCC と 22 個の健康なコントロールで循環 emRNA シーケンスが実行されました。 候補 emRNA は、テスト段階とトレーニング段階で 108 個の ccRCC と 70 個の健康なコントロールを使用して評価されました。 emRNA ベースのシグネチャはロジスティック回帰分析によって作成され、106 人の ccRCC、97 人の健康な対照、および 73 人の良性個人の追加コホートで検証されました。

5 つの emRNA、CUL9、KMT2D、PBRM1、PREX2、SETD2 が、ccRCC の新規バイオマーカー候補として同定されました。 さらに、RCC 検出用に、KMT2D および PREX2 で構成される初期診断シグネチャと、CUL9、KMT2D、および PREX2 で構成される鑑別診断シグネチャを開発しました。 初期の診断シグネチャは、ccRCC と健康な対照の区別において高い精度を示し、トレーニングコホートおよび検証コホートにおける受信者動作特性曲線下面積 (AUC) はそれぞれ 0.836 および 0.830 でした。 鑑別診断シグネチャーは、固形腫瘤 (AUC = 0.810) や嚢胞性腫瘤 (AUC = 0.832) を含む良性腎腫瘤 (AUC = 0.816) から ccRCC を区別する際にも優れた性能を示しました。

我々は、ccRCCの早期検出と不確実な腎腫瘤の鑑別診断のための新しいemRNAベースのシグネチャを確立し、検証しました。 これらのサインは、ccRCC 検出のための有望な非侵襲性バイオマーカーとなり、ccRCC 患者の予後を改善する可能性があります。

1. 循環エキソソーム RNA 配列決定により、明細胞腎細胞癌 (ccRCC) の新規の潜在的なバイオマーカーが同定されました。

2. KMT2D および PREX2 を含む初期診断シグネチャは、ccRCC と健康な個人を区別する際に高い精度を示しました。

3. CUL9、KMT2D、および PREX2 を含む鑑別診断シグネチャーは、良性腎腫瘤から ccRCC を区別する際に優れた性能を示しました。

4. これらのサインは、ccRCC 検出のための有望な非侵襲性バイオマーカーとなる可能性があります。

査読レポート

腎細胞癌 (RCC) は腎尿細管上皮細胞に由来し、悪性腎腫瘍の 90% 以上を占めます [1]。 RCCの発生率は世界中で着実に増加しており、発展途上国では増加率が高く、先進国では発生率が高くなります[2]。 初期のRCCは臓器に限定されており、5年生存率は90%以上です。 しかし、RCCが局所臓器に浸潤したり、遠隔に広がったりすると、腫瘍の治療は非常に複雑になり、予後は不良になります[3]。 明細胞性腎細胞癌 (ccRCC) は最も一般的なサブタイプであり、新たに診断された腎細胞癌の約 75% を占めます [1]。 したがって、ccRCC を正確に早期に検出することは、RCC の管理にとって非常に重要です。 残念ながら、これまでのところ、ccRCC の早期診断のための証明された腫瘍バイオマーカーはありません。

エキソソームは、核酸、タンパク質、脂質、アミノ酸、代謝産物などの分子を含む細胞によって分泌される直径 40 ~ 150 nm の小さな細胞外小胞であり、細胞間のコミュニケーションや、細胞の生理学的および病理学的プロセスの調節において重要な役割を果たしています。人体[4]。 さらに重要なことは、エクソソームの脂質二重膜構造は外因性プロテアーゼや RNA 酵素の影響に耐性があり、メッセンジャー RNA (mRNA)、マイクロ RNA (miRNA)、機能性タンパク質などのより安定した物質を生成することです [5、6]。 さまざまな分子を運ぶ腫瘍由来のエクソソームは、癌を検出するための有望な非侵襲的方法を提供する可能性があります [7]。

最近、循環エキソソーム RNA (exRNA) ががん検出の有望なバイオマーカーとして機能する可能性があることが新たな報告で示されています [8、9、10]。 研究では、血液および尿中のエキソソーム miRNA が腎細胞癌と健康な対照を効果的に区別できることが示されており、エクソソーム miRNA が RCC を検出するためのバイオマーカーとして使用できる可能性があることが示唆されています [11、12]。 ERCC1 グループによる低分子 RNA 配列決定の広範な採用と研究者の最近の探索により、他の RNA バイオタイプ、特に長鎖 RNA が検査されています [13]。 最近の研究では、細胞外小胞長 RNA (exLR)、主に mRNA が、前立腺がん (PCa) [14]、神経膠腫 [15]、肝細胞がん (HCC) [16、17]、膵管腺がん ( PDAC) [18] など。ccRCC を検出するための emRNA を同定しようとするいくつかの予備研究が発表されているが、その臨床成績は研究デザイン (つまり、サンプルサイズが小さい [19]、真陰性の欠如など) のために大きく制限されている。対照[19]、臨床サンプルでの検証の欠如[20])。

この研究では、局所的な ccRCC と健康な対照の間の RNA シーケンスによる循環エクソソーム mRNA (emRNA) プロファイリングを体系的に調査し、多数の ccRCC 関連 emRNA を発見しました。 次に、488 人の参加者からなる大規模コホートにおいて、診断の可能性があるいくつかの emRNA を特定し、検証しました。 最後に、ccRCC の早期診断のための emRNA に基づくシグネチャを確立しました。

参加者の発見、検査、訓練、検証コホートの人口統計学的および臨床的特徴を表 1 および追加ファイル 2: 表 S1 に示します。 参加者の発見、検査、訓練、検証コホートにおいて、局在性ccRCCと健康な対照との間の性別と年齢の分布に有意差はなかった(表1)。 検証コホートにおけるccRCCグループの参加者と良性腫瘤患者グループでは、ccRCCと良性対照の間の年齢分布は同様であった。 平均ベースライン腫瘍サイズは、局在性 ccRCC の 4 つのコホートですべて 4 cm 未満でした。 局在性 ccRCC の 4 つのコホートにおける臨床腫瘍病期は T1 ~ 2 でした。 ccRCC症例の大部分では、病理学的グレードはG1〜2でした(発見コホートで83.3%、検査コホートで93.8%、訓練コホートで88.0%、検証コホートで96.2%)。 良性固形腫瘤および嚢胞性腫瘤グループの参加者の人口統計学的および臨床的特徴は、追加ファイル 2: 表 S1 に示されています。 固形群では男性の参加者が少なく、固形群の参加者は嚢胞性グループや ccRCC グループよりも若かった。 腫瘍サイズは、充実性群よりも嚢胞性群の方が大きかった。

発見段階では、RNA-seq による 12 個の局在 ccRCC (n = 12) と健康な対照 (n = 22) の間の循環 emRNA プロファイリングを調査しました。 次に、RNA 配列データに基づいて、210 個の調節不全 emRNA (p < 0.05、倍率変化 > 2 または < 0.5、FDR < 0.05、追加ファイル 2: 表 S3) が特定されました。 ヒートマップは、代表的な ccRCC 関連 emRNA の発現レベルを示しました (追加ファイル 1: 図 S2A)。 CUL9、ATM、ARID1A、KMT2D、PBRM1、PREX2、SETD2 など、ccRCC または複数の悪性腫瘍に関連する 7 つの上位に上方制御される emRNA が、さらなる検査のための候補バイオマーカーとして選択されました。 次に、局所的な ccRCC (n = 16) と健康な対照 (n = 20) の追加コホートにおいて、RT-qPCR によってこれら 7 つの候補 emRNA の発現レベルをテストしました。 ATM と ARID1A は、ccRCC 群と健常群の間に差が見られなかったため除外されました (追加ファイル 1: 図 S2B)。 最後に、ccRCC で上方制御された残りの 5 つの emRNA (CUL9、KMT2D、PBRM1、PREX2、SETD2) がトレーニングと検証のために含まれました (追加ファイル 1:図 S2B)。

トレーニング段階では、局所的な ccRCC (n = 92) と健康な対照 (n = 50) を含む 142 の臨床サンプルの追加コホートで emRNA の発現レベルが RT-qPCR によって検出され、CUL9、KMT2D、 PBRM1、PREX2、およびSETD2は、健常群よりもccRCC群で有意に高く、各候補バイオマーカーは、局所的なccRCCを健常対照と区別するのに優れた性能を達成し、対応するAUCは0.611、0.668、0.639、0.742、および0.680でした。それぞれ(表2、図1A、および追加ファイル1:図S3A)。 さらに、KMT2D および PREX2 は、多変量ロジスティック回帰分析によって ccRCC 診断の重要なバイオマーカーとしてさらに同定されました (表 2)。 次に、これら 2 つの emRNA が、局所的な ccRCC (n = 106) と健康な対照 (n = 97) の追加コホートで検証されました。 健常群と比較して、ccRCC 群では KMT2D および PREX2 の高い発現レベルが観察されました (図 1B)。 KMT2DおよびPREX2の診断精度は、それぞれ0.655および0.776のAUCを有しました(表2、追加ファイル1:図S3B)。 多変量ロジスティック回帰分析の後、KMT2D および PREX2 は依然として、局所的な ccRCC を対照から区別する統計的有意性を示しました (表 2)。

ccRCC 関連循環 emRNA を検証し、emRNA に基づく明細胞腎細胞癌 (ccRCC) の早期診断サインを確立します。 トレーニング段階における局所的な ccRCC (n = 92) と健康なコントロール (n = 50) の間の、CUL9、KMT2D、PBRM1、PREX2、SETD2 を含む ccRCC 関連循環 emRNA の発現レベルを示す散布図。 B 検証段階における局在性 ccRCC (n = 106) と健康な対照 (n = 97) の間の多変量ロジスティック回帰分析により、ccRCC 診断の重要なバイオマーカーとして同定された KMT2D および PREX2 の発現レベルを示す散布図。 C、D ROC-AUC 評価は、トレーニング段階 (n = 142) および検証段階 (n = 203) で、局所的な ccRCC を健康な対照から区別するための、KMT2D および PREX2 を含むシグネチャの診断性能を示しました。 ccRCC、明細胞腎細胞癌。 ROC、受信機オペレータ特性。 AUC、曲線下面積

トレーニングコホート (n = 142) では、多変量ロジスティック回帰分析を使用して、KMT2D と PREX2 を含む emRNA ベースの ccRCC シグネチャを確立しました。 AUC で測定したシグネチャの診断性能 (logit (p = ccRCC) = 1.21943 × KMT2D + 1.97072 × PREX2 + 1.30485) は 0.836 (p < 0.001; 95% CI、0.765 ~ 0.893、図 1C) でした。 トレーニングセットから特定された新規バイオマーカー (KMT2D および PREX2) は、参加者 (n = 203) の検証コホートに適用されました。 次に、これらの遺伝子を上記のモデルに適用して ROC を構築しました。 診断シグネチャは、ccRCC と健康な対照の区別においても高い精度を示し、受信者動作特性曲線下面積 (AUC) は 0.830 (p < 0.001; 95% CI、0.771 ~ 0.879、図 1D) でした。 これらの結果は、emRNA シグネチャが健康な対照からの ccRCC の早期検出のための新しい方法として機能する可能性があることを示しました。

小さな腎腫瘤から ccRCC を診断することは非常に重要です。 したがって、固形腫瘤 (n = 47) および嚢胞性腫瘤 (n = 26) を含む良性腎腫瘤 (n = 73) を有する参加者から追加のサンプルを収集し、CUL9、KMT2D を含む 5 つの候補 emRNA の診断的役割を評価しました。 、PBRM1、PREX2、SETD2 は、良性腎腫瘤を有する患者から ccRCC を区別する際に役立ちます。 我々はまず、ccRCCと良性腎腫瘤患者の間で候補emRNAの発現レベルを評価した。 良性腎腫瘤を有する患者と比較して、ccRCC では CUL9 および PREX2 の高い発現レベルが観察されました (図 2A)。 CUL9、KMT2D、およびPREX2の診断力は、それぞれ0.619、0.585、および0.629のAUCを有しました(表3、追加ファイル1:図S3C)。 多変量ロジスティック回帰分析の後、これら 3 つの候補は依然として、多変量 p 値 < 0.0001、< 0.0001、および 0.0001 で、良性腎腫瘤を有する患者から ccRCC を区別する統計的有意性を示しました (表 3)。 腎腫瘤の鑑別診断において、ccRCCと健康な対照を区別するために導出されたシグネチャの性能を評価するために、本発明者らは、良性腎腫瘤を有する患者からccRCCを鑑別する際にシグネチャを適用した。 ただし、AUCによって評価されたシグネチャの診断性能はわずか0.559であり(追加ファイル1:図S4)、健康な対照からccRCCを検出するためのシグネチャは腎腫瘤の鑑別診断には適用できないことを示しています。 次に、ロジスティック回帰分析を使用して、CUL9、KMT2D、および PREX2 を使用して emRNA ベースの診断シグネチャを確立しました。logit (p = ccRCC) = 1.68689 × CUL9 − 1.16173 × KMT2D + 1.17881 × PREX2 + 0.75145。 このシグネチャは、良性腎腫瘤を有する患者からの ccRCC の診断において優れた性能を示しました (AUC = 0.816、p < 0.001; 95% CI、0.751 ~ 0.870、図 2B)。 さらに、診断サインは、良性固形腫瘤(AUC = 0.810、p < 0.001; 95% CI、0.739 ~ 0.869、図 2C)および良性嚢胞性腫瘤(AUC = 0.832、p < 0.001)から ccRCC を区別する優れた能力も示しました。 ;95%CI、0.757〜0.891、それぞれ図2D)。 これらの結果は、emRNA に基づく診断シグネチャが、ccRCC 診断を改善するための新規な非侵襲性バイオマーカーである可能性があることを示しました。

emRNA ベースの腎明細胞癌 (ccRCC) 診断シグネチャの確立。 局在性 ccRCC (n = 106) と良性腎腫瘤患者 (n = 73) の間の、CUL9、KMT2D、PBRM1、PREX2、SETD2 などの候補 emRNA の発現レベルを示す散布図。 B ROC-AUC 評価は、CUL9、KMT2D、および PREX2 を含む診断シグネチャーの診断性能が、局所的な ccRCC (n = 106) と良性腎腫瘤を有する患者 (n = 73) を区別することを示しました。 C、D ROC-AUC 評価は、CUL9、KMT2D、および PREX2 を含むシグネチャの診断性能により、局所的な ccRCC (n = 106) と良性固形腫瘤 (n = 47) および良性嚢胞性腫瘤 (n = 26) を有する患者を区別できることを示しました。 。 ccRCC、明細胞腎細胞癌。 ROC、受信機オペレータ特性。 AUC、曲線下面積

最も危険な泌尿器科悪性腫瘍の 1 つである ccRCC には、理想的な診断ツールや戦略がまだありません。 英国の706人の患者を対象とした多施設前向き観察コホート研究では、RCCの早期発見の重要性が詳しく説明され、RCC関連症状に焦点を当てることはRCCの早期診断の改善に限定されることが示唆された[21]。 診断戦略の改善と診断用バイオマーカーの同定にはさらに注意を払う必要があります。

RCC患者の約60%は偶発的に診断され、そのほとんどは画像検査によって診断されます[21]。 超音波検査は比較的安価で便利で安全な検査であり、サイズが 3 cm を超える腫瘍は 85 ~ 100% 検出できますが、サイズが 2 ~ 3 cm の腫瘍は 67 ~ 82% しか検出できません。 - 超音波を使用したサイズ 3 cm 未満の腫瘍の検出では陰性の結果が得られます [22]。 一方、コンピュータ断層撮影法 (CT) と磁気共鳴画像法 (MRI) は、RCC の検出において超音波よりも感度が高く、特異的です。 しかし、費用対効果と放射線量が低いため、集団スクリーニングに CT または MRI が推奨される可能性は低いです [23]。 さらに、CT または MRI 検査では、さまざまな不確実な内臓腫瘤の過剰診断につながる可能性のあるその他の偶発的所見が検出されることがよくあります。 したがって、費用対効果が高く、正確で、実行可能で、リスクの低い ccRCC のスクリーニング手法の作成を考慮する必要があります。

現在、ccRCC の診断バイオマーカーの発見に特化した研究の数が増加しています。 血清および尿中に見出されるいくつかのバイオマーカーは、RCCを非腎泌尿器腫瘍、良性腎腫瘤、および健康な対照から区別できる新しいスクリーニングまたは診断ツールとして推奨されている[24]。 研究者らは、ccRCCおよび乳頭状RCC患者(n = 47)において尿AQP1およびPLIN2が有意に上方制御されていることを発見し、RCCのスクリーニングバイオマーカーおよび腎腫瘤の鑑別診断ツールとしての高い可能性を示した[25]。 ただし、サンプルサイズが小さいため、尿 AQP1 と PLIN2 をさらに検証する必要があります。 別の研究者グループは、RCCの早期検出を向上させるために、N-メチルトランスフェラーゼ(NNMT)、L-プラスチン(LCP1)、および非転移性細胞1タンパク質(NM23A)で構成される血清/血漿3マーカーアッセイを開発しました。 3マーカーアッセイは、健康な対照および良性腫瘍と比較してRCCに対して高い感度、特異性、および診断用AUC(95.6%、90.9%、および0.932)を有するが、良性腎腫瘤からRCCを区別する能力は限られている[26]。 一般に、血液または尿を使用するリキッドバイオプシーには、RCC の早期発見と鑑別診断を向上させる大きな可能性が依然として残されています。

エクソソームの特性により、エクソソーム関連アッセイは疾患の診断とモニタリングのための非侵襲的で効果的な方法としてますます注目を集めています[8、27]。 診断と治療におけるエクソソームの強力な可能性は、前立腺がん、膀胱がん、乳がんなどのいくつかの種類のがんで証明されています [28、29]。 現在、エクソソーム RNA、特に miRNA が RCC の検出に大きな可能性を秘めている可能性があることが研究でわかっています [30]。 血清および血清エキソソームの両方において、MiR-21 レベルは健康な対照よりも ccRCC で高かった。 血清エキソソーム miR-210 は、ccRCC と対照を効果的に区別できました (AUC = 0.8779) [31]。 別の研究では、血清エキソソーム miR-210 および miR-1233 が ccRCC を診断するための新規バイオマーカーである可能性があることが判明しました [32]。 エクソソーム miRNA シーケンスによって発見された hsa-mir-149-3p および hsa-mir-424-3p は、健常対照よりも RCC で発現レベルが高いことを発見した人もいます [12]。 しかし、これらの以前の研究は循環 miRNA に焦点を当てており、ccRCC の早期検出における循環 emRNA の潜在的な役割を調査した研究はまだありません。 この研究では、局所的な ccRCC と健康な対照の間の RNA シーケンスによる循環 emRNA プロファイリングを体系的に調査し、多数の ccRCC 関連 emRNA を発見しました。 次に、診断の可能性がある 5 つの ccRCC 関連 emRNA を同定し、ccRCC 検出に優れた能力を備えた emRNA ベースのスクリーニング シグネチャを確立しました。 このサインは、正常集団から ccRCC を選別するための新しいバイオマーカーとして機能する可能性があります。

断面イメージングの普及により、腎腫瘤、特に小さな腎腫瘤(SRM、直径 < 4 cm)の発生率が大幅に増加しました [33]。 SRM は鑑別診断の難易度を高めます。 4 cm 未満の腎腫瘤の 20% が良性の組織型であると特定されたが、7 cm 以上の腎腫瘤の良性組織型の割合は 6.3% であったと報告されています [34]。 腎臓の腫瘤は、固形腫瘤、嚢胞性腫瘤、および炎症性腫瘤に分類できます [35]。 腎腫瘤を有する患者の大多数は無症候性であり、腎腫瘤の主な形態は充実性および嚢胞性です。 臨床現場で最も一般的な良性固形腎腫瘤は血管筋脂肪腫(AML)です [36、37]。 しかし、低脂質AMLと呼ばれるAMLの5%近くは、脂肪が少なすぎてCTやMRIで診断できない[38、39]。 したがって、脂質の少ないAMLはRCCと区別することが難しく、これらの腫瘍の一部は手術後に診断されます[40]。 腎腫瘍細胞腫 (RO) は、通常、顆粒状の好酸性細胞質を持つ大きな細胞を含む良性上皮新生物です [41]。 しかし、腎周囲脂肪浸潤は RO 症例の 2 ~ 20% で発生し、RO 症例の約 5.4% では血管浸潤が見られます [42]。 これらの特徴は一般に RCC における悪性腫瘍の特徴であると考えられており、鑑別診断の困難さを増大させる可能性があります。 一方、ほとんどの腎嚢胞性腫瘤は非腫瘍性嚢胞性ですが、多くの腎腫瘍には少量または主要な成分として嚢胞が含まれています。 したがって、腎嚢胞性腫瘤の良性と悪性の鑑別診断が必要である[43]。 ccRCC を同定するには、腎悪性腫瘤を良性の固形腫瘤および嚢胞性腫瘤から区別することが重要です。 鑑別診断の非侵襲的方法の開発は、臨床現場において依然として大きな潜在的価値を持っています。

私たちの研究では、さらに 106 人の ccRCC と良性腎腫瘤を有する 73 人の患者から血清を収集し、多変量段階的ロジスティック回帰分析によってスクリーニングされた 3 つの候補遺伝子を含む ccRCC 診断サインを構築しました。 このサインは、充実性か嚢胞性かを問わず、良性腎腫瘤を有する患者から ccRCC を区別する優れた能力を示しました。 したがって、診断サインは、嚢胞性腎癌、低脂肪血管筋脂肪腫、腎腫瘍細胞腫など、腎腫瘤の性質が不確かなものを区別することができます。特に、腫瘤が小さく、画像診断によって腫瘍の本質を判断できない場合に顕著です。

私たちの研究にはいくつかの限界もありました。 まず、単一施設の後ろ向き研究として、サンプルサイズが限られていました。 この発見、特に腎腫瘤を診断するための emRNA シグネチャの性能については、さらなる多施設共同前向き大規模研究で検証する必要があります。 第二に、他のタイプの腎嚢胞性腫瘤のサンプルが不十分なため、我々の研究ではボシュニャク語グレードの腎腫瘤の鑑別診断を行うことができませんでした。 最後に、この研究は主に腫瘍の早期診断に適した末梢血中のバイオマーカーの探索に焦点を当てていましたが、喫煙、肥満、高血圧、その他の変数などの臨床的要因の分析は含まれていませんでした。追跡調査で腫瘍の包括的な診断および予後モデルを確立します。 細胞実験や動物実験も実施されておらず、特定の理論的裏付けが欠けており、エキソソーム mRNA と RCC の役割と分泌機構は今後も研究が続けられるでしょう。

私たちは、循環emRNAプロファイリングを初めて使用した体系的なccRCCバイオマーカー調査を報告しました。 我々は、ccRCCの早期検出と不確実な腎腫瘤の鑑別診断のための新しいemRNAベースのシグネチャを確立し、検証しました。 これらのサインは、ccRCC 検出のための有望な非侵襲性バイオマーカーとなり、ccRCC 患者の予後を改善する可能性があります。

この研究は、上海長海病院(中国、上海)の臨床研究倫理委員会によって承認されました(番号CHEC2020-112)。 すべての臨床サンプルは上海長海病院から入手されました。 サンプリング前に参加者から書面によるインフォームドコンセントを得た。 この研究では、限局性ccRCC(n = 226)、良性腎腫瘤患者(n = 73)、健康対照者(n = 189)を含む488人の参加者が、2017年8月から2020年7月まで連続して募集された。外科病理学によって確認され、2人の独立した病理学者によって検査されました。 腫瘍の病期と病理学的グレードは、2017 年に米国癌合同委員会 (AJCC) によって提案された第 8 回 TNM 基準に従って推定されました。腎腫瘤を有する患者の対象基準は次のとおりです。(1) 年齢 20 ~ 80 歳。 (2) 手術前のCTスキャン。 (3)病理検査による確定診断。 (4)臨床腫瘍ステージIおよびII(限局性腎癌)を有するccRCC参加者。 (5) 外科手術を受け、サンプリング前にいかなる抗がん治療も受けていない。 (6) 他の癌の病歴がない。 (7) インフォームドコンセントへの署名。 健康な対照の包含基準は次のとおりであった: (1) 年齢 20 ~ 80 歳、(2) 健康診断を受け、無症状で健康であると考えられる、(3) 超音波検査で腫瘤は示されなかった、および (4) インフォームドコンセントに署名した。 。 除外基準は次のとおりであった:(1)以前に腎腫瘤と診断されたこと、(2)アブレーション治療を受けたこと、および(3)他の悪性腫瘍を患っていること。

この研究は、発見、テスト、トレーニング、検証の 4 つのフェーズで構成されています。 発見、トレーニング、検証フェーズの参加者は連続して登録され、これらのグループにランダムに割り当てられました。 テストフェーズの参加者は、トレーニングフェーズからランダムに選択されました。 ワークフローの概要を図 3 にまとめます。参加者の臨床的特徴を表 1 にまとめます。発見段階では、ccRCC (n = 12) と健康な対照 (n = 22) の循環 emRNA プロファイリングを調査しました。 RNA配列 ccRCC における調節不全 (p < 0.05、倍数変化 > 2 または < 0.5、FDR < 0.05) の emRNA が同定されました。 ccRCC または/または多発性悪性腫瘍にも関連し、上方制御された 7 つの emRNA が、さらなるトレーニングと検証のための候補バイオマーカーとして選択されました (追加ファイル 3: サポート情報の「候補バイオマーカーの選択戦略」の詳細を参照)。 試験段階では、局所的な ccRCC (n = 16) と健康な対照 (n = 20) で候補 emRNA の発現レベルを RT-qPCR によって評価しました。 トレーニング段階では、テスト段階で特定された重要なemRNAの発現レベルが、局所的なccRCC(n = 92)と健康な対照(n = 50)の別のコホートでRT-qPCRによって評価されました。 段階的ロジスティック回帰分析を使用して、重要な予測因子を特定し、emRNA ベースの ccRCC サインを確立して、ccRCC を健康な対照から区別しました。 次に、局在性 ccRCC (n = 106) と健康な対照 (n = 97) の追加コホートで署名が検証されました。 さらに、良性腎腫瘤を有する患者から ccRCC を区別する際の候補 emRNA の診断性能を評価しました。 この段階では、充実性腎腫瘤 (n = 47) および嚢胞性腎腫瘤 (n = 26) を含む良性腎腫瘤 (n = 73) を有する患者が含まれました (詳細な臨床的特徴は追加ファイル 2: 表 S1 にまとめられています)。 )。 同様に、段階的ロジスティック回帰分析を適用して重要な予測因子を特定し、充実性および嚢胞性腫瘤を含む良性腎腫瘤を有する患者から ccRCC を区別するための emRNA ベースのシグネチャを確立しました。

研究設計のワークフロー。 ccRCC、明細胞腎細胞癌。 RNA-seq、RNA シーケンス。 emRNA、エクソソームメッセンジャーRNA。 PCR、ポリメラーゼ連鎖反応

腎腫瘤のある患者は入院初日にインフォームドコンセントに署名し、2日目の朝に絶食末梢血を採取しました。 健康な対照者は健康診断当日にインフォームドコンセントに署名し、健康診断の前に絶食末梢血を採取した。 サンプルは 4 °C の冷蔵庫に保管され、氷と一緒に研究室に運ばれました。 血液サンプルを室温で最短 30 分間、最長 2 時間かけて凝固させました。 次に、すべてのサンプルを 1600 × g で 15 分間遠心分離して血清を分離し、血清 (上清) を 1.5 ml 遠心管に集めて番号を付けました。 血清サンプルは、さらなる処理まですぐに -80 °C で保存されました。

exoEasy Maxi Kit (No. 76064、Qiagen、デュッセルドルフ、ノルトライン ヴェストファーレン州、ドイツ) を使用して、メーカーの指示に従って血清からエクソソームを精製しました。 まず、血清を 0.22 μm のフィルター膜で濾過し、等量の XBP 緩衝液を加え、穏やかに反転して 5 回混合しました。 混合後、上記のサンプル混合物を吸着カラムに加え、室温で 500 × g で 1 分間遠心分離しました。 通過溶液を吸着カラムから廃棄した。 この手順を 1 回繰り返しました。 次に、洗浄のために約 5 ml の XWP バッファーを吸着カラムに加え、室温で 5000 × g で 5 分間遠心分離しました。 吸着カラムを廃棄し、血清エキソソームを吸着カラム膜に固定化した。 その後、吸着カラムを新しいコレクションチューブに移し、400μlのXEバッファーをカラムに加えて溶出し、室温で1分間インキュベートし、500×gで5分間遠心分離した。 最後に、収集チューブ内の溶出液を吸着カラムに戻し、室温で 1 分間インキュベートしました。 溶出液を5000×gで5分間遠心分離し、1.5ml遠沈管に移した。 エクソソームはさらなる研究に使用したり、-80 °C で保存したりできます。

精製したエクソソームサンプルを PBS (SH30256.01、HyClone、ローガン、ユタ州、米国) で 100 倍に希釈し、電子顕微鏡 (JEM-1400、日本電子、昭島市、東京、日本) に使用しました。 合計 20 μl の希釈サンプルをピペットで取り、銅メッシュの中心に滴下し、20 分間放置しました。 次に、液体を濾紙で吸い取り、ネガティブ染色液を調製した。 ネガティブ染色を 1% リンタングステン酸で約 10 秒間行い、濾紙を使用して過剰な液体を吸い取りました。 次に、20 μl ddH2O を銅メッシュの中心に注意深く加え、20 秒後、残りの液体を濾紙でメッシュから吸引しました。 完成した銅メッシュは、エクソソーム識別の準備が整いました。 TEM は、丸みを帯びた両凹ディスク形状の小胞様構造としてエキソソームの存在を示しました (追加ファイル 1: 図 S1A)。

抽出されたエクソソームを 1:200 に希釈しました (濾過した PBS)。 Nano Sight 300 (Malvern Instruments Ltd.、英国マルバーン) で検出したモジュールを ddH2O で 3 回洗浄し、その後モジュールをシリンジポンプエアで 7 ~ 8 回パージして、可能な限り多くの残留液体を除去しました。 よく混合して希釈したエクソソーム サンプル 1 ミリリットルをシリンジでモジュールに吸引し、モジュール検出チャンバー内の気泡を排出しました。 画像キャプチャの繰り返し数は 3 に設定され、各キャプチャの継続時間は 60 秒に設定されました。 NTAは、RCC、良性腫瘤を有する患者、および健康な対照からの循環エクソソームのピークがそれぞれ74 nm、77 nm、および79 nmであり、50〜200 nmの範囲であることを示しました(追加ファイル1:図S1B)。

合計50μlのRIPA溶解緩衝液(P0013C、Beyotime、上海、中国)および0.5μlのプロテ​​アーゼ阻害剤を抽出したエキソソームに添加した。 混合物を 4 °C、15,000 × g で 20 分間遠心分離しました。 上清を収集し、BCA キット (5,000,112、Bio–Rad、Hercules、CA、USA) を使用して濃度を測定しました。 次に、5 × ローディングバッファー (P0015、Beyotime、上海、中国) をサンプルに添加しました。 これらのサンプルを 99 °C の金属浴 (ThermomixerComfort、Eppendorf、Hamburg、Germany) で 15 分間インキュベートしました。 PAGE Gel Fast Preparation Kit (PG112、EpiZyme、上海、中国) を使用して、メーカーの指示に従って 10% 分離接着剤と 5% 濃縮接着剤を作成しました。 次に、30μgのエキソソームタンパク質サンプルを各ウェルに加え、5μlのタンパク質マーカー(P0077、Beyotime、上海、中国)をブランクウェルに加えました。 機械 (165-8029、Bio-Rad、Hercules、CA、USA) を 120 V に設定し、電気泳動を 2 時間実行しました。 電気泳動が完了し、ゲルを除去した後、PVDF (IPFL00010、Millipore、バーリントン、マサチューセッツ州、米国) メンブレンと重ね、トランスファータンクに置き、トランスファーバッファーで満たしました。 機器は 2 時間 300 mA に設定されました。 転写が完了した後、メンブレンを 5% BSA で室温で 2 時間ブロックし、適切な位置でメンブレンを切断しました。 次に、CD9 (1:1000; AP1482D、ABGENT、江蘇省蘇州、中国)、CD63 (1:500; AP5333B、ABGENT、蘇州、江蘇、中国)、CD81 (1:4000; AM8557B、ABGENT、蘇州、江蘇省、中国)、TSG101(1:2000; AM8662b、ABGENT、蘇州、江蘇省、中国)、およびβ-アクチン(1:5000; A5441、Sigma、セントルイス、ミズーリ州、米国)を添加し、4°でインキュベートしましたC一晩。 翌日、メンブレンを室温に 15 分間置き、一次抗体を除去しました。 膜をTBSTで各回5分間6回洗浄した。 次に、二次抗体を添加し、室温で 2 時間インキュベートし、TBST で各回 5 分間、6 回洗浄しました。 Clarity Max Western ECL 基板 (P0018 FS、Beyotime、上海、中国) が追加されました。 ブロットは画像化装置 (e-Blot、上海、中国) によって画像化されました。 WBは、CD9、CD63、CD81、TSG101などのエクソソームバイオマーカーが単離されたエクソソームで検出可能であることを示しました(追加ファイル1:図S1C)。

循環エキソソーム RNA を、exoRNeasy 血清/プラズマ マキシ キット (217,084、Qiagen、デュッセルドルフ、ノルトライン ヴェストファーレン州、ドイツ) を使用して精製しました。 トータル RNA シーケンスでは、インプットとして 0.25 ~ 50 ng の RNA を使用しました。 gDNA の除去は、HL-dsDNase (70,800-202、ArcticZymes、トロムソ、ノルウェー) および反応バッファー (66,001、ArcticZymes、トロムソ、ノルウェー) を添加することによって実行されました。 トータル RNA シーケンス用のライブラリーは、SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2-Pico Input Mammalian (634,413、Clontech、マウンテンビュー、カリフォルニア州、米国) を使用して調製しました。 メーカーのプロトコールと比較すると、断片化ステップは 94 °C で 2 分に設定されています。 以降は、高度に分解された RNA から開始するオプションに従いました。 ライブラリーの調製には、cDNA 合成、5 サイクルのインデックス PCR、リボソーム cDNA 除去、および 9 ~ 16 サイクルの濃縮 PCR も含まれます。 各ライブラリーのサイズは Agilent High Sensitivity DNA Kit (5067-4626、Agilent、カリフォルニア州サンタクララ、米国) で測定し、濃度はライブラリー定量キット (638,324、Clontech、カリフォルニア州マウンテンビュー、米国) で測定しました。 あるいは、Qubit dsDNA HS キット (Q32854、Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム) によってライブラリーを定量することもできます。 ライブラリーを等モルのプールにまとめ、サイズと濃度を測定し、HiSeq 2500 プラットフォーム (Illumina、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国) を使用してライブラリーの配列を決定しました。 品質を確保するには、ライブラリごとに 10 GB の生データが必要でした。

配列決定データは、FastQC によって品質管理処理され、次のパラメーターを使用して Trimmomatic によってトリミングされました: 最小長 30、スライディング ウィンドウ 4、および必要な品質 15。その後、クリーンなデータは、STAR によって参照ヒトゲノム (GRCh38.p13) にマッピングされました。 Ensembl リリース 95 遺伝子アノテーション データベースを使用します。 最後に、htseq を発現定量化に使用し、R パッケージ Deseq2 を使用して、異なるグループ間で差次的に発現される遺伝子を特定しました。 調節不全遺伝子の偽陽性率を減らすために、Benjamini-Hochberg による複数の検定を実行して調整された p 値を取得しました。

PCR 産物の検証は、DNA ゲル電気泳動を使用して実行されました。 まず、60 mlのTAEと1 gの固体アガロースを混合し、完全に透明になるまで加熱しました。 温かくなったら、6μlの核酸染色液を加え、よく振って、接着剤製造ラックに注ぎました。 櫛歯が完全に固まるまで差し込み、その後櫛歯を抜き取りました。 アガロースゲルを電気泳動槽に入れ、液面がゲルを越えるまで 1 × TAE 溶液を加え、上部サンプルウェル内の気泡を排出しました。 サンプルがロードされました。 電気泳動条件は通常、120 V で 30 分間に設定されました。 ランニング後、ゲルの画像が得られました。

exoRNeasy Serum/Plasma Maxi Kit (217,084、Qiagen、デュッセルドルフ、ノルトライン ヴェストファーレン州、ドイツ) を使用して、循環エクソソーム RNA を抽出および精製しました。 PrimeScript™ RT 試薬キット (RR047A、たから、京都、日本) の指示に従って、RNA を cDNA に逆転写しました。 操作は氷上で行い、マスターミックスは反応回数の2倍量を調製してください。 次に、各反応チューブに 10 μl を分注します。 逆転写反応条件は、37℃で60分間、85℃で5秒間、使用前に氷上で冷却した。 合成された cDNA は、その後の qPCR にすぐに使用することも、-20 °C で一時的に保存することもできます。

プライマーとプローブは追加ファイル 2: 表 S2 に示されています。 ABI 7500 蛍光 PCR 装置 (Applied Biosystems、米国カリフォルニア州フォスターシティ) を使用しました。 20 μl の qPCR システム、具体的には 10 μl の 2 × qPCR Master Mix と 2 μl の cDNA 溶液を使用し、上流および下流プライマーの使用濃度は 10 μM、プローブは 5 μM の濃度で使用しました。反応液をRNaseを含まない水で20μlにした。 qPCR 手順は次のように設定しました: 37 °C で 5 分間、95 °C で 10 分間、95 °C で 15 秒間および 59 °C で 1 分間の伸長を 40 サイクル。

emRNA の定量には標準曲線定量法を適用しました。 この方法は、他の RNA タイプに使用されている以前のアプローチに似ています [44]。 簡単に言うと、各標的遺伝子の増幅断片を合成しました。 これらの遺伝子の逆転写中に、さまざまなコピー数濃度勾配で合成された転写物をテストすることにより、リアルタイム定量的 PCR を使用して標準曲線を作成しました。 これにより、標準サンプルに対する標的遺伝子のコピー数を計算することができました。 具体的には、エキソソームから RNA を抽出するための 400 µl の血清の初期量が定義されました。 次に、抽出したRNAをRNase-free水に溶解した。 次に、20 μl の emRNA を逆転写処理して、60 μl の cDNA を得ました。 次に、2 μl の cDNA を 20 μl の蛍光 PCR システムに加え、3 回のサンプルにアクセスして平均 CT 値を求めました。 同時に、コピー数 103、104、105、106、および 107 でターゲット RNA 転写物を合成しました。これらの合成された mRNA は、上記の転写物と同じ手順を使用して処理されました(20 μl の emRNA を 60 μl の cDNA、および 2 μl cDNAを20μlのPCRシステムに添加)。 これらの合成された mRNA から標準曲線が得られ、CT 値を標準曲線と照合することで標的 emRNA のコピー数を計算できました。

この研究に登録された集団の臨床的特徴のベースライン分析は、SPSS 21.0 (IBM Corporation、米国ニューヨーク州アーモンク) によって処理されました。 測定データは正規性および分散均一性検定で検定され、正規分布を満たし、グループ計画で t 検定で検定された独立サンプル (分散の不均一性には t' 検定が使用されました)、マン-ホイットニー U 検定が行われました。正規分布を満たさない場合に使用されます。 正規分布については対応のある t 検定を、非正規性についてはウィルコクソンの符号付き順位検定を使用して、対応のあるデータの平均差の正規性を検定しました。 カウントデータにはカイ二乗検定またはフィッシャーの正確確率検定を使用しました。

遺伝子発現の比較分析、グラフ化のための一元配置分析、および p 値の計算などの実験結果は、GraphPad Prism 8 (GraphPad Software、San Diego、CA、USA) によって実行されました。 Z スコア (z = (x − μ)/σ; μ = Average(); σ = stdevp()) は、データを正規化するためにデータの前処理に適用されました。 MedCalc 18.0 ソフトウェア (MedCalc Software、ベルギー、オステンド) を使用して、ロジスティック回帰によって臨床診断モデルを確立し、曲線下面積 (AUC)、感度、および特異度を計算しました。 差異は、p < 0.05 で統計的に有意であるとみなされました。 ROC 曲線下面積の値の範囲は 0.5 ~ 1 で、低診断値は 0.5 ~ 0.7、中程度の診断値は 0.7 ~ 0.9、高診断値は 0.9 を超えます。

現在の研究中に分析された臨床データセットは、この公開された論文とその補足情報ファイルに含まれており、エクソソーム RNA 配列データは、合理的な要求に応じて CNGB 配列アーカイブ (CNSA: https://db.cngb.org/cnsa) にアクセスして入手できます。 /) アクセッション番号 CNP0002099 の CNGBdb 。

血管筋脂肪腫

曲線下の面積

明細胞腎細胞がん

コンピュータ断層撮影

エクソソームmRNA

エクソソームRNA

磁気共鳴画像

ナノ粒子追跡分析

ポリメラーゼ連鎖反応

受信機オペレータの特性

小さな腎腫瘤

透過電子顕微鏡法

ウエスタンブロット

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適用できない。

この研究は、中国国家自然科学財団(NSFC)(FW 81902616)、上海教育開発財団および上海市教育委員会の曙光プログラム(16SG33 HY)、および科学分野の科学技術支援プロジェクトからの助成金によって支援されました。上海科学技術行動計画の生物医学 (19441909200、FW)。

Xing He、Feng Tian、Fei Guo、Fangxing Zhang、Huiyong Zhang も同様にこの作品に貢献しました。

海軍医科大学(第二軍医科大学)長海病院泌尿器科、168 長海路、上海、200433、中国

Xing He、Fei Guo、Jin Ji、Lin Zhao、Jingyi He、Yutian Xiao、Bo Yang、Huamao Ye

泌尿器科、上海第8人民病院、8 Caabao Road、上海、200235、中国

フォン・ティアン&フォン・チャン

広西チワン族自治区ゲノム・個別化医療センター ゲノム・個別化医療重点研究所、広西医科大学ゲノム・個別化医療連携イノベーションセンター、22 Shuangyong Road, Nanning, 530021, Guangxi, China

Fangxing Zhang、Huiyong Zhang、Longman Li、Chunmeng Wei、Caihong Huang、Yexin Li、Fubo Wang

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コンセプトとデザイン: XH、FW、HY、BY。 実験の実行: XH、FG、および FZ2 (Feng Zhang)。 臨床データ収集: FT、HZ、JJ、および FZ。 臨床サンプルの収集とサンプル処理: JH、LZ、および JJ。 データの分析と解釈: FW、FT、FG、FZ1 (Fangxing Zhang)、HZ、YX、LL、CW、CH。 原稿の起草:XH、FZ1(Fangxing Zhang)、YL。 原稿のレビューと編集: FW、HY、BY、FT。 研究監修:FW、HY、BY。 著者全員が最終原稿を読んで承認しました。

Bo Yang、Huamao Ye、または Fubo Wang に対応します。

この研究は、上海長海病院の臨床研究倫理委員会によって承認されました(番号CHEC2020-112)。 参加者から書面によるインフォームドコンセントを得た。

掲載の同意

適用できない。

著者らは、競合する利益を持たないことを宣言します。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

図S1。 エキソソームの単離と検証の品質管理。 図S2。 循環エクソソーム RNA のスクリーニングと検査。 図S3。 局所性明細胞腎細胞癌 (ccRCC) 患者を健康な対照からスクリーニングし、良性腎腫瘤を有する患者から ccRCC を区別するための候補 emRNA のパフォーマンス。 図S4。 良性腎腫瘤に対する ccRCC と健康な対照から ccRCC を区別するために導出されたシグネチャの AUC (AUC = 0.559)。

表S1。 良性固形腫瘤および嚢胞性腫瘤を持つ参加者の人口統計学的および臨床的特徴。 表S2。 プライマーとプローブのリスト。 表S3。 明細胞腎細胞癌 (ccRCC) 患者と健常対照間の循環エクソソーム異常調節転写産物のリスト。

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転載と許可

He、X、Tian、F.、Guo、F. 他。 明細胞腎細胞癌の早期診断のための循環エキソソーム mRNA サイン。 BMC Med 20、270 (2022)。 https://doi.org/10.1186/s12916-022-02467-1

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受信日: 2022 年 3 月 23 日

受理日: 2022 年 7 月 4 日

公開日: 2022 年 8 月 25 日

DOI: https://doi.org/10.1186/s12916-022-02467-1

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